在細(xì)胞培養(yǎng)中，顯微鏡是觀察細(xì)胞狀態(tài)、密度、形態(tài)、污染情況及判斷傳代或?qū)嶒?yàn)時(shí)機(jī)的核心工具。由于觀察對(duì)象是活細(xì)胞、透明且附著在培養(yǎng)皿底，其操作技巧與觀察病理切片有很大不同。

以下是一些核心的操作技巧，主要針對(duì)倒置顯微鏡（*常用的細(xì)胞培養(yǎng)觀察工具）：

一、 觀察前的準(zhǔn)備與原則

優(yōu)先使用倒置顯微鏡：

培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿的底部通常較?。?.5-1mm），倒置顯微鏡的物鏡從下方觀察，可以直接看到貼壁細(xì)胞，無需將培養(yǎng)液倒掉或加蓋玻片，既無菌又保留細(xì)胞原本形態(tài)。

如果使用正置顯微鏡，必須用培養(yǎng)皿蓋或特制的培養(yǎng)皿，否則高倍物鏡可能會(huì)碰到液面。

保持無菌意識(shí)：

觀察前用75%酒精擦拭培養(yǎng)瓶/皿外壁（特別是瓶口和底部）。

如果需要在超凈臺(tái)外觀察（如放在桌面顯微鏡上），務(wù)必?cái)Q緊瓶蓋，防止污染。

盡量避免手直接觸碰鏡頭（手上有油脂和細(xì)菌）。

二、 核心觀察技巧（光路與調(diào)焦）

這是新手*容易出錯(cuò)的地方，關(guān)鍵在于調(diào)整光的對(duì)比度，因?yàn)榛罴?xì)胞是透明的。

必須使用相差模式（Phase Contrast）：

將顯微鏡上的相差環(huán)（通常在載物臺(tái)下方聚光鏡處）轉(zhuǎn)到 “PH1” 或 “PH2” （對(duì)應(yīng)10x或20x物鏡）。

如果顯微鏡沒有相差功能，可以縮小光圈（減小聚光鏡的孔徑光闌）來人為增加對(duì)比度，但圖像會(huì)變暗且分辨率下降。

原理：普通明場(chǎng)下，透明細(xì)胞與培養(yǎng)液幾乎無反差，只能看到輪廓。相差顯微鏡可以將光通過細(xì)胞時(shí)產(chǎn)生的相位差轉(zhuǎn)換為明暗差。 

操作： 

調(diào)焦技巧：先找“緣”，再找“底”： 

針對(duì)培養(yǎng)瓶：培養(yǎng)瓶底部有弧度。如果調(diào)焦一直模糊，說明你正在看液面氣泡或瓶身上層。

正確方法：先用低倍鏡（4x或10x），將旋鈕快速向遠(yuǎn)調(diào)（升高物鏡或降低載物臺(tái)），直到視野中出現(xiàn)劃痕、灰塵或氣泡壁（這代表你調(diào)到了瓶底表面），然后再微調(diào)聚焦到細(xì)胞。

針對(duì)培養(yǎng)皿/孔板：底部是平的，直接聚焦到網(wǎng)格線或邊緣。一個(gè)實(shí)用技巧：先觀察培養(yǎng)皿邊緣的水滴凝結(jié)或標(biāo)記筆痕跡，找到清晰的平面后，再移到視野中央。

判斷細(xì)胞健康狀況（重點(diǎn)）：

凋亡：細(xì)胞變圓、皺縮、漂浮、折光性消失（黑色透亮）。

細(xì)菌污染：背景中出現(xiàn)大量黑色小點(diǎn)（球菌）或細(xì)長桿狀物，并且這些黑點(diǎn)在高倍鏡下會(huì)快速運(yùn)動(dòng)（布朗運(yùn)動(dòng)或主動(dòng)游動(dòng)）。

支原體污染：細(xì)胞形態(tài)改變（如出現(xiàn)黑色細(xì)絲、細(xì)胞碎片增多），但肉眼很難看到支原體本身（需要DAPI染色或PCR檢測(cè)）。

好細(xì)胞：折光性強(qiáng)，輪廓清晰，有立體感，胞膜完整，核仁可見（如HeLa細(xì)胞貼壁呈梭形，核周有“暈”）。

差細(xì)胞/污染：

三、 觀察后的收尾與常見問題

油鏡使用的特殊要求：

在細(xì)胞培養(yǎng)中，盡量不要用油鏡。因?yàn)橛蜁?huì)污染培養(yǎng)皿底部，且難以清除，導(dǎo)致后續(xù)觀察模糊。

如果必須看100x油鏡（如檢查細(xì)胞內(nèi)顆粒），需將細(xì)胞培養(yǎng)在專用玻璃底培養(yǎng)皿上，且觀察后立即用無水乙醇擦凈。

避免熱漂移：

剛拿到手的培養(yǎng)皿（從培養(yǎng)箱取出）溫度較低（37℃），在室溫下鏡臺(tái)會(huì)迅速降溫。鏡頭和樣品溫差會(huì)導(dǎo)致圖像持續(xù)漂移。

對(duì)策：觀察前將培養(yǎng)皿在顯微鏡臺(tái)面上靜置1-2分鐘，讓其溫度穩(wěn)定。

記錄與標(biāo)記：

觀察時(shí)，建議在培養(yǎng)瓶上標(biāo)記“傳代”、“加藥”、“拍照（固定）”等狀態(tài)。

對(duì)于多孔板，用馬克筆在板蓋和板底對(duì)應(yīng)位置畫圈，鎖定你需要觀察的特定孔，避免反復(fù)移動(dòng)找位置。

四、 進(jìn)階技巧（提升效率）

使用低倍鏡快速掃描：

先用4x物鏡找到細(xì)胞貼壁生長的區(qū)域（通常是培養(yǎng)瓶的中央或一側(cè)），判斷鋪滿度（Confluency）。初學(xué)者常犯的錯(cuò)誤是用10x或20x去看局部，導(dǎo)致誤判整體密度。

巧用培養(yǎng)皿的“記號(hào)”：

很多培養(yǎng)皿底部有網(wǎng)格或字母。用油性筆在網(wǎng)格交匯處標(biāo)記位置，方便在加藥后快速找回同一視野進(jìn)行時(shí)間點(diǎn)觀察。

數(shù)字成像技巧：

拍照時(shí)，關(guān)閉自動(dòng)白平衡。因?yàn)榧?xì)胞在相差模式下是灰白色背景，自動(dòng)白平衡會(huì)讓細(xì)胞偏藍(lán)或偏黃。

如果照片背景偏亮（光暈），可以適當(dāng)降低聚光鏡高度或微微傾斜培養(yǎng)皿（注意不要污染鏡頭）。

總結(jié)下來，*核心的三點(diǎn)：

用相差模式（PH），解決透明細(xì)胞看不見的問題。

調(diào)焦到瓶底劃痕/邊緣，避免對(duì)著液面空氣瞎調(diào)。 

觀察漂浮顆粒和背景黑點(diǎn)，快速判斷污染。

另外，如果在使用過程中發(fā)現(xiàn)什么細(xì)節(jié)不清楚，可以隨時(shí)問我。